Real Time PCR Nedir
1988 yılında thermus aquaticus bakterisinin enzimlerinden saflaştırılarak, ısıya oldukça dayanıklı polimerazın (taq polimeraz) kullanımı ile beraber polimeraz zincir reaksiyonlarının sağlanması için (PCR) otomatize termal siklüs (periyot) cihazları geliştirilmeye başlanmıştır. Floresan ile ışıma tekniklerinin de bu alanda kullanılmaya başlanmasıyla kinetik revers transkriptaz-PCR (RT-PCR)’da bir devrim yaşanmıştır. Bu sayede tümör hücrelerinin ilaç dirençlerin başta olmak üzere, kemoterapik hücre taramalarına ve tümör evrelerinin molekül çaplı saptanmasına kadar uzanan birçok farklı alanda DNA anlatımını sayısal bir değer olarak ölçmek mümkün olmuştur.
Bu gelişim sayesinde artık DNA kopyalarının düzeylerini sayısal olarak ölçmek, devam eden PCR reaksiyonunu monitorize ederek Real Time (eşzamanlı) olarak reaksiyonun gidişini izlemek ve müdahalelerde bulunmak ile PCR döngülerinin sayısını değiştirebilmek mümkün kılınmıştır.
Real Time PCR gen teknolojileri alanında birçok kolda kullanılmakla beraber, genel kullanım alanları şunlardır:
- Gen ekspresyonunun kantitasyonu (DNA sayımı),
- Viral kantitasyon (Viral yaygınlık ölçümü)
- Patojenlerin tespiti (pnömoni, penisilin duyarlılığı),
- DNA hasar tespiti (özellikle radyoaktivite sonucu oluşan DNA hasarının tespitinde kullanılır),
- Metilasyon tespiti,
- KİT sonrası kimerizmin izlenmesi,
- KİT sonrası MRD izlenmesi,
- Genotipleme (melting-curve) analizi,
- Anne kanından izole edilen tek hücrede prenatal tanı,
- Hemoglobinopatilerin prenatal tanısı,
Real Time PCR gen teknolojilerinin gelişmesiyle insanoğlunun yaşamında birçok değişikliğe sebep olmuştur. Bu değişikliklerinin çoğu olumlu yöndedir. Bunlar:
- Konvarsiyonal PCR yani rutin PCR (klasik PCR) son aşamada değerlendirilebilecek bir durumdur. Ancak Real Time PCR eşzamanlı görüntüleme teknolojisi sayesinde büyüme ve gelişme aşamasında tespite imkan kılar.
- Konvarsiyonal ölçümlerde ihtiyaç duyulandan 1000 kat daha az RNA ile çalışmak mümkündür.
- Hassas değişim ölçümü yapılabilir. Bu sayede çok küçük değişikliklerin bile gözlenmesi sağlanır.
- Floresan gücü arttıkça replikasyon çoğalır.